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Société de Neuroendocrinologie

Zone de texte éditable et éditée et rééditée

Arnaud Menuet

15 juin 2003

Expression et régulation des récepteurs de l'œstradiol et de l'aromatase B chez les Poissons téléostéens

Au niveau du système nerveux central des vertébrés, l'œstradiol (E2) intervient dans de nombreux processus tels que la différenciation neuronale, la mise en place et l'activité des régions neuroendocrines, la régulation des fonctions cognitives et la neuroprotection. Ses effets sont médiés notamment par l'intermédiaire de récepteurs nucléaires, les récepteurs à l'œstradiol (ER), intervenant comme des facteurs de transcription ligand-dépendants modulant l'expression de gènes cibles. Chez les mammifères deux sous-types de ER ont été isolés, ERalpha et ERß. Bien que présentant une distribution différentielle et des caractéristiques fonctionnelles distinctes, le rôle exact de chacune de ces formes in vivo reste encore mal connu.

Les ERs de poissons présentent des similitudes avec ceux des mammifères, cependant certaines formes et isoformes sont spécifiques de cette classe. Une isoforme de ERalpha délétée d'une partie de l'extrémité N-terminale de la protéine, ERalpha-short, a été isolée chez quelques espèces de poisson ainsi que chez le poulet et chez le xénope. Cette isoforme spécifique des ovipares coexiste au niveau du foie avec une forme ERalpha non délétée, ERalpha-long. Les travaux réalisés chez la truite ont démontré que ERalpha-short était pourvue d'une activité ligand-indépendante constitutive. Cette particularité fonctionnelle pourrait impliquer cette isoforme dans des processus physiologiques indépendamment des taux d'E2 circulant. D'autre part, des études récentes démontrent l'existence chez les poissons de deux formes de ER affiliées au sous-type ERß des tétrapodes. Ces nouvelles formes, ERß1 et ERß2, sont générées par des gènes distincts, mais il n'existe pratiquement pas d'information quant à leur distribution et leur fonctionnalité.

Outre ces particularités, les poissons possèdent également des caractéristiques concernant leur activité à métaboliser les stéroïdes sexuels au niveau cérébral. En effet, la capacité du cerveau de poisson à aromatiser les androgènes en œstrogènes est 100 à 1000 fois supérieure à celle des mammifères. Les analyses moléculaires ont mis en évidence que cette activité est majoritairement liée à l'existence d'une forme d'aromatase, ARO-b, spécifique du cerveau. Des résultats récents, obtenus chez le poisson crapaud, ont montré que les messagers et la protéine ARO-b étaient majoritairement exprimés dans les cellules de la glie radiaire du cerveau adulte. De plus, des résultats obtenus par RT-PCR ont montré que l'expression de l'ARO-b pouvait être induite par l'E2 chez l'embryon de poisson zèbre. Cette induction étant inhibée par des traitements avec des antagonistes des ERs démontre que cette régulation implique directement les ERs.

L'objectif de ce travail était d'aborder les mécanismes d'actions génomiques de l'E2 au niveau de différents tissus cibles et notamment au niveau du système nerveux central chez les poissons.

Pour cela dans une première partie, la distribution tissulaire et cérébrale des différentes formes de ERß (ERß1 , ERß2) et isoformes de ERalpha (ERalpha-short, ERalpha-long) a été analysée. Par la suite, nous avons étudié la capacité de ERalpha-short et des ERßs à induire la transcription E2-dépendante de gènes synthétiques ou endogènes et à être eux mêmes régulés par l'E2.

Dans une seconde partie, nous avons étudié la distribution des messagers de l'ARO-b en comparaison avec celle des messagers ERalpha dans le cerveau de truite. La régulation œstrogénique du gène ARO-b a été abordée in vivo sur des embryons de poisson zèbre et in vitro dans différents types cellulaires après isolement de la partie promotrice du gène.

Dans un premier temps, la distribution tissulaire des deux isoformes fonctionnellement distinctes, ERalpha-long et ERalpha-short a été analysée tout au long de l'axe gonadotrope chez la truite. L'organisation particulière du gène ERalpha de truite a permis d'obtenir des outils moléculaires spécifiques de chacune des isoformes. Ainsi, la réalisation d'expériences de protection à la nucléase S1, d'hybridation in situ et de RT-PCR a permis de mettre en évidence que la forme ERalpha-long était la seule forme détectable au niveau du cerveau, de l'hypophyse et des ovaires. Cependant, dans le foie, les deux isoformes de ERalpha sont clairement exprimées. Ces résultats montrent d'une part que la forme non délétée, ERalpha-long, est l'isoforme ERalpha majoritaire au niveau du système nerveux central et d'autre part que la présence spécifique de la forme ERalpha-short au niveau du foie pourrait impliquer cette isoforme dans le développement et/ou le maintien de la fonction de vitellogenèse hépatique.

Par la suite, nous avons cloné trois formes distinctes de ER chez le poisson zèbre, ERalpha, ERß1 et ERß2. Des analyses de Scatchard ont montré que ces formes générées par des gènes distincts sont capables de lier spécifiquement l'E2. Des expériences de transfection transitoire de cellules montrent que chacune des formes de ER est capable d'induire un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un élément de réponse à l'E2 consensus (ERE). L'analyse de la distribution tissulaire par RT-PCR démontre la présence des trois messagers au sein des différents tissus cibles de l'E2 tels que le cerveau, l'hypophyse, les gonades et le foie. Au niveau du système nerveux central, ERalpha, ERß1 et ERß2 sont détectables par hybridation in situ dans les principales régions neuroendocrines. Cependant même si les signaux se chevauchent partiellement, une distribution différentielle a clairement été mise en évidence, suggérant une régulation et des rôles distincts pour chacune des trois formes.

Afin d'aborder la spécificité fonctionnelle des ERs, nous avons analysé leur action sur le contrôle d'un gène endogène bien identifié comme œstrogèno-dépendant, le gène ERalpha. En effet, les études réalisées sur la régulation de ce gène chez différentes espèces d'ovipares incluant les poissons, ont clairement démontré son autorégulation positive. Dans un premier temps, par Northern-blot, nous avons analysé les effets d'un traitement oestrogénique sur l'expression hépatique des différentes formes de messagers ERalpha, ERß1, ERß2 chez le poisson zèbre. Cette expérience a permis de confirmer la régulation positive par l'E2 des messagers ERalpha in vivo. De plus, alors que le traitement est sans effet sur l'expression des messagers ERß2, l'expression des ARNm ERß1 est diminuée. Ces résultats impliquent que les trois formes de ER sont différentiellement régulées par E2 et qu'elles exerceraient des fonctions différentes notamment sur le processus de vitellogenèse. Par la suite, le promoteur du gène ERalpha de poisson zèbre a été isolé et les effets des trois ERs sur son activité ont été testés par transfection transitoire dans différents types cellulaires. La réalisation de mutations et de délétions des régions promotrices a permis d'isoler un ERE imparfait responsable de l'induction E2-dépendante. Le promoteur est inductible par ERalpha et plus faiblement par ERß2 alors qu'aucune induction claire n'a été observée avec la forme ERß1. Ces résultats montrent que l'augmentation de l'expression du gène ERalpha après traitement à l'E2 observée in vivo pourrait être provoquée par ERalpha lui même mais également par ERß2. L'incapacité de ERß1 à induire le gène ERalpha dénote une fonctionnalité différente de cette forme de récepteur.

Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la distribution et à la régulation œstrogénique de la forme cérébrale de l'aromatase B. Tout d'abord, par hybridation in situ et par immunohistochimie sur des cerveaux de truite adulte, nous avons montré une forte expression des ARNm et de la protéine ARO-b dans la partie antérieure du cerveau incluant notamment les régions neuroendocrines. Le marquage périventriculaire obtenu correspond essentiellement aux cellules de la glie radiaire confirmant ainsi les résultats précédemment obtenus chez le poisson crapaud. Ces résultats posent le problème de la signification physiologique de la forte expression constitutive d'ARO-b dans la glie radiaire chez les poissons.

Bien que l'aromatase ait été décrite comme étant régulée par l'E2 et soit exprimée dans les mêmes régions que ERalpha, notre analyse comparative réalisée par hybridation in situ ne montre pas de colocalisation significative entre les messagers ERalpha et ceux de l'ARO-b. Cependant, les deux types de messagers sont détectables par RT-PCR dans des cultures primaires de cellules de cerveaux de truite enrichies en cellules gliales. Ce résultat suggère que l'induction E2-dépendante du gène ARO-b pourrait passer par une très faible expression de ERalpha dans la glie radiaire, indétectable par hybridation in situ.

Afin d'approfondir ces données, nous avons étudié la régulation oestrogénique de l'aromatase B chez l'embryon de poisson zèbre. Après avoir isolé la région promotrice du gène, nous avons analysé in vitro sa régulation par les différents ERs dans différents types cellulaires. Des traitements à l'E2 réalisés sur des embryons de 48 heures ont permis de confirmer que l'aromatase était fortement induite par l'E2 in vivo. Ces résultats obtenus par RT-PCR ont été confirmés par hybridation in toto. La balnéation d'embryons dans l'E2 provoque après 48 heures l'apparition d'un fort marquage, indétectable chez les témoins, au niveau du telencéphale, de l'aire préoptique et de l'hypothalamus. Ces effets sont bloqués par l'ICI, suggèrant fortement l'implication des ERs. Comme chez l'adulte, le marquage obtenu est périventriculaire et correspond, très vraisemblablement, aux cellules de la glie radiaire.

Les études réalisées par co-transfection de chaque vecteur d'expression ER (ERalpha, ERß1 , ERß2) avec un gène luciférase placé sous le contrôle du promoteur de l'ARO-b, ont permis de mettre en évidence d'une part, que les trois formes de ER sont susceptibles d'induire ce gène et, d'autre part, que cette induction est dépendante du contexte cellulaire. En effet, alors que les effets d'un traitement à l'E2 sont faibles ou inefficaces sur l'expression du gène rapporteur dans des lignées telles que les cellules CHO, Hela, PC12 et P19 indifférenciées, l'induction est considérable (de l'ordre de 50 fois) dans des lignées de cellules neuro-gliales ou gliales telles que les P19 différenciées et les cellules astrocytaires U251. Des effets-doses de vecteur d'expression ERalpha démontrent que de très faibles quantités de ER permettent d'obtenir une induction significative. De plus, la réalisation de constructions contenant des délétions et des mutations de la région promotrice met clairement en évidence la présence d'un ERE imparfait, nécessaire mais non suffisante, responsable de cette induction par les ERs. La corrélation des résultats obtenus in vivo et in vitro suggèrent, d'une part, que la présence d'une faible expression de ER pourrait être responsable de l'induction de l'aromatase dans la glie radiaire et, d'autre part, que l'intervention de facteurs gliaux-spécifiques permettrait l'induction E2-dépendante du promoteur.

En conclusion, de part l'existence de différentes formes et isoformes de ER chez les poissons, l'ensemble de ce travail montre la complexité d'action de l'E2 au niveau cérébral. Chez la truite, contrairement à l'isoforme ERalpha-short spécifique du foie, l'isoforme ERalpha-long est exprimée dans l'ensemble des principaux tissus cibles de l'E2 et notamment au niveau du système nerveux central. Nous avons également isolé trois formes de ER chez le poisson zèbre, ERalpha, ERß1, ERß2 et nos résultats relatifs à leur fonctionnalité, leur expression et leur régulation suggèrent que chaque forme de ER est impliquée de façon différentielle dans les processus physiologiques.Nos travaux concernant la mise en évidence de l'expression de l'aromatase dans les cellules gliales ouvrent de nouvelles perspectives concernant les fonctions de l'E2 au niveau du système nerveux central de poisson. L'excellente corrélation entre les résultats observés in vivo et in vitro sur la régulation œstrogènique du promoteur de l'aromatase suggère, en accord avec ceux obtenus sur les cellules gliales de truite en culture, qu'une très faible expression de ER dans les cellules gliales pourrait être suffisante pour induire l'expression du gène de l'aromatase B. Au vu de ces résultats, il est tentant de penser que les forts niveau d'expression d'aromatase observés in vivo dans le cerveau de poisson adulte seraient liés à une stimulation constitutive par l'E2. Les cellules de la glie radiaire interviennent lors de la neurogenèse chez les embryons de mammifères et disparaissent à l'âge adulte. Leur persistance chez les poissons adultes et la présence de l'aromatase suggèrent que l'E2 produit localement par ces cellules pourrait être impliqué dans le processus de croissance continue du cerveau observé chez les poissons adultes.

Mots clefs : Aromatase B, cyp19a1b, œstradiol, androgènes, récepteurs aux œstrogènes, neurogénèse, cellules gliales radiaires, poisson zèbre, téléostéen

Présentée en Juin 2003

Laboratoire où a été préparée la thèse :

Equipe d'Endocrinologie Moléculaire de la Reproduction, UMR CNRS 6026, Rennes

Nom du directeur de thèse: Olivier Kah et Farzad Pakdel (CNRS 6026, Rennes)