En savoir plus

Notre utilisation de cookies

« Cookies » désigne un ensemble d’informations déposées dans le terminal de l’utilisateur lorsque celui-ci navigue sur un site web. Il s’agit d’un fichier contenant notamment un identifiant sous forme de numéro, le nom du serveur qui l’a déposé et éventuellement une date d’expiration. Grâce aux cookies, des informations sur votre visite, notamment votre langue de prédilection et d'autres paramètres, sont enregistrées sur le site web. Cela peut faciliter votre visite suivante sur ce site et renforcer l'utilité de ce dernier pour vous.

Afin d’améliorer votre expérience, nous utilisons des cookies pour conserver certaines informations de connexion et fournir une navigation sûre, collecter des statistiques en vue d’optimiser les fonctionnalités du site. Afin de voir précisément tous les cookies que nous utilisons, nous vous invitons à télécharger « Ghostery », une extension gratuite pour navigateurs permettant de les détecter et, dans certains cas, de les bloquer.

Ghostery est disponible gratuitement à cette adresse : https://www.ghostery.com/fr/products/

Vous pouvez également consulter le site de la CNIL afin d’apprendre à paramétrer votre navigateur pour contrôler les dépôts de cookies sur votre terminal.

S’agissant des cookies publicitaires déposés par des tiers, vous pouvez également vous connecter au site http://www.youronlinechoices.com/fr/controler-ses-cookies/, proposé par les professionnels de la publicité digitale regroupés au sein de l’association européenne EDAA (European Digital Advertising Alliance). Vous pourrez ainsi refuser ou accepter les cookies utilisés par les adhérents de l'EDAA.

Il est par ailleurs possible de s’opposer à certains cookies tiers directement auprès des éditeurs :

Catégorie de cookie

Moyens de désactivation

Cookies analytiques et de performance

Realytics
Google Analytics
Spoteffects
Optimizely

Cookies de ciblage ou publicitaires

DoubleClick
Mediarithmics

Les différents types de cookies pouvant être utilisés sur nos sites internet sont les suivants :

Cookies obligatoires

Cookies fonctionnels

Cookies sociaux et publicitaires

Ces cookies sont nécessaires au bon fonctionnement du site, ils ne peuvent pas être désactivés. Ils nous sont utiles pour vous fournir une connexion sécuritaire et assurer la disponibilité a minima de notre site internet.

Ces cookies nous permettent d’analyser l’utilisation du site afin de pouvoir en mesurer et en améliorer la performance. Ils nous permettent par exemple de conserver vos informations de connexion et d’afficher de façon plus cohérente les différents modules de notre site.

Ces cookies sont utilisés par des agences de publicité (par exemple Google) et par des réseaux sociaux (par exemple LinkedIn et Facebook) et autorisent notamment le partage des pages sur les réseaux sociaux, la publication de commentaires, la diffusion (sur notre site ou non) de publicités adaptées à vos centres d’intérêt.

Sur nos CMS EZPublish, il s’agit des cookies sessions CAS et PHP et du cookie New Relic pour le monitoring (IP, délais de réponse).

Ces cookies sont supprimés à la fin de la session (déconnexion ou fermeture du navigateur)

Sur nos CMS EZPublish, il s’agit du cookie XiTi pour la mesure d’audience. La société AT Internet est notre sous-traitant et conserve les informations (IP, date et heure de connexion, durée de connexion, pages consultées) 6 mois.

Sur nos CMS EZPublish, il n’y a pas de cookie de ce type.

Pour obtenir plus d’informations concernant les cookies que nous utilisons, vous pouvez vous adresser au Déléguée Informatique et Libertés de l’INRA par email à cil-dpo@inra.fr ou par courrier à :

INRA
24, chemin de Borde Rouge –Auzeville – CS52627
31326 Castanet Tolosan cedex - France

Dernière mise à jour : Mai 2018

Menu SNE

Société de Neuroendocrinologie

Zone de texte éditable et éditée et rééditée

Amor Belmeguenai

11 juin 2004

Contrôle neurotensinergique des cellules mélanotropes de l'hypophyse de grenouille: caractérisation pharmacologique des récepteurs et étude du mécanisme de transduction

La neurotensine (NT) est un neuropeptide de 13 acides aminés présent tant au niveau du système nerveux central que dans les organes périphériques. La NT agit à la fois en tant que neurotransmetteur excitateur, neuromodulateur, facteur neurotrophique et neurohormone hypophysiotrope. La NT se lie à trois types de récepteurs (NTR1, NTR2 et NTR3) pour lesquels la pharmacologie et les mécanismes de transduction n'étaient pas totalement élucidés au moment où nous avons commencé ce travail. Le lobe intermédiaire de l'hypophyse de grenouille est constitué d'une population homogène de cellules endocrines, les cellules mélanotropes, qui sécrètent l'hormone mélanotrope alpha (alpha-MSH). Ces cellules présentent une activité électrique spontanée sous-tendue par l'activation de canaux membranaires Na+, Ca2+ et K+. Les activités électrique et sécrétrice des cellules mélanotropes sont soumises à un contrôle multifactoriel d'origine hypothalamique. Des études antérieures réalisées dans notre laboratoire ont révélé que la NT stimule in vitro l'activité sécrétrice des cellules mélanotropes de grenouille. Les cellules mélanotropes constituent donc un modèle particulièrement adapté pour étudier le mécanisme d'action de la NT. Les objectifs du présent travail étaient i) d'étudier l'effet de la NT sur l'activité électrique des cellules mélanotropes en culture primaire et de caractériser le profil pharmacologique des récepteurs impliqués dans la réponse électrophysiologique, ii) d'élucider les mécanismes de transduction associés à l'activation des NTRs et iii) d'identifier les conductances ioniques mises en jeu dans les effets électrophysiologiques de la NT sur les cellules mélanotropes.

Nous avons montré que la NT provoque une dépolarisation membranaire qui s'accompagne d'une augmentation de la fréquence d'émission des potentiels d'action. A l'aide d'une série de ligands, nous avons mis en évidence l'existence d'une forte corrélation entre l'effet d'analogues de la NT (8-13) sur l'activité électrique des cellules mélanotropes et leur affinité pour le récepteur NTR1 de rat ou le récepteur NTR2 de souris exprimés par les cellules COS-7. Par ailleurs, l'utilisation d'antagonistes non peptidiques des NTRs a confirmé que le récepteur exprimé par les cellules mélanotropes de grenouille présente des caractéristiques pharmacologiques à la fois semblables et distinctes de celles des NTR1 et NTR2 de mammifères.

Nous avons ensuite recherché les voies de signalisation intracellulaires activées par les NTRs exprimés par les cellules mélanotropes. La préincubation des cellules avec les toxines cholérique et pertussis, ou la dialyse des cellules avec les analogues des guanines phosphates et des antagonistes des protéines Gs/i/o et Gq/11 a démontré que les NTRs sont couplés à des protéines G de type q ou 11. L'activation de ces récepteurs induit une production d'inositol trisphosphate (IP3) et une augmentation de la concentration calcique cytosolique ([Ca2+]c). Le traitement des cellules par un inhibiteur de phospholipase C (PLC) ou des antagonistes des récepteurs de l'IP3 a mis en évidence le rôle de la PLC et de la mobilisation du Ca2+ des compartiments intracellulaires induite par l'IP3 dans les réponses électrique et sécrétrice des cellules mélanotropes. La chélation des ions Ca2+ extracellulaires ou le blocage des canaux calciques de types L et N a révélé qu'un influx de Ca2+ contribue également aux réponses des cellules mélanotropes à la NT. Le traitement des cellules avec des inhibiteurs de la protéine kinase C (PKC) a montré l'implication de la PKC dans le maintien de la sensibilité des cellules à la NT. Ces observations indiquent que la NT stimule les activités électrique et sécrétrice des cellules mélanotropes via l'activation de la voie PLC/PKC et l'influx de Ca2+. Nous avons également étudié les mécanismes ioniques mis en jeu dans la dépolarisation membranaire et l'émission des potentiels d'action induites par la NT. Le blocage des canaux Na+, K+ et Ca2+ de types L et N ne modifie pas la dépolarisation membranaire, mais inhibe la genèse des potentiels d'action évoquée par la NT. L'application de NT active un courant entrant de charge positive qui s'inverse vers -30 mV, un potentiel proche du potentiel d'équilibre du chlore. La substitution des ions Cl- par du gluconate ou l'addition de bloqueurs de canaux Cl- réduit la réponse bioélectrique à la NT, ce qui suggère que l'effet dépolarisant du peptide résulte d'un efflux de chlore. La modification de la [Ca2+]c par vidange des compartiments calciques intracellulaires ou la chélation du Ca2+ cytosolique supprime la réponse électrique à la NT, démontrant ainsi la sensibilité du courant Cl- au Ca2+. La NT active également, dans les cellules mélanotropes dépolarisées, un courant sortant de charges positives qui est supprimé par des bloqueurs des courants potassiques. Nous avons montré que la NT augmente l'amplitude du courant potassique activé par le Ca2+ (IKCa) ce qui pourrait faciliter les post-potentiels hyperpolarisants qui suivent chacun des potentiels d'action, permettant ainsi la levée d'inactivation des canaux sodiques et calciques impliqués dans la genèse des potentiels d'action. L'absence d'effet d'un antagoniste de la calmoduline ou d'un inhibiteur de la protéine kinase dépendante de la calmoduline et du Ca2+ (CamKII) sur la dépolarisation membranaire générée par la NT indique que l'activation des courants lors de l'augmentation de la [Ca2+]c n'est pas relayée par la CamKII. L'analyse biophysique et pharmacologique des courants calciques a montré que les cellules mélanotropes expriment essentiellement les courants à haut seuil d'activation de types L et N (ICaL, N). La NT réduit de façon réversible l'amplitude de ces courants. Toutefois, l'étude des courants calciques générés par les potentiels d'action émis en réponse à l'application de NT révèle que la NT augmente fortement l'influx de Ca2+ par élévation de la fréquence de décharge des potentiels d'action. La réduction d'amplitude des ICaL, N est atténuée par les antagonistes des récepteurs de l'IP3, la vidange des compartiments calciques intracellulaires et les inhibiteurs de PKC. Ces résultats montrent que l'activation de la voie PLC/PKC induite par la NT est responsable de la réduction de l'amplitude des ICaL, N dans les cellules mélanotropes.

L'ensemble de ce travail révèle que la NT stimule les activités électrique et sécrétrice des cellules mélanotropes de grenouille en activant des récepteurs couplés aux protéines Gq/11 et présentant des caractéristiques pharmacologiques intermédiaires entre les NTR1 et NTR2 de mammifères. L'activation de ces récepteurs stimule la PLC, entraînant la formation d'IP3 et la mobilisation du Ca2+ des compartiments intracellulaires sensibles à l'IP3. L'augmentation de la [Ca2+]c active i) la sécrétion d'alpha-MSH, ii) un courant sortant de chlore qui induit une dépolarisation membranaire à l'origine de la genèse de potentiels d'action et iii) la PKC qui réduit l'amplitude des courants calciques L et N et favorise le maintien de la sensibilité des cellules à la NT. L'émission des potentiels d'action provoque un influx massif de Ca2+ au travers des canaux L et N. L'augmentation de la [Ca2+]c qui en résulte active le courant IKCa impliqué dans les post-potentiels hyperpolarisants nécessaires au maintien de l'excitabilité des cellules. Globalement, la mobilisation du Ca2+ des compartiments intracellulaires initie les réponses sécrétrice et électrique des cellules mélanotropes à la NT, puis l'influx de Ca2+ prolonge l'effet stimulateur du peptide sur la sécrétion d'alpha-MSH.

*******************
Summary :

Neurotensin (NT) is a tridecapeptide present in the central nervous system (CNS) and in various peripheral organs. NT acts as an excitatory neurotransmitter, neuromodulator and hypophysiotropic neurohormone. The effects of NT are mediated by three types of NT receptors (NTR1, NTR2 and NTR3) whose pharmacological characteristics and transduction pathways are not fully elucidated. The intermediate lobe of the frog pituitary is composed of a single population of endocrine cells, the melanotrophs, that release alpha-melanocyte-stimulating hormone (alpha-MSH). Melanotrophs exhibit spontaneous electrical activity underlain by activation of Na+, Ca2+ and K+ channels. The electrical and secretory activities of melanotrophs are under multifactorial hypothalamic control. Previous in vitro studies performed in our laboratory have shown that NT is a potent stimulator of alpha-MSH secretion. The specific objectives of the present study were i) to examine the effects of NT on the electrical activity of cultured frog melanotrophs and to characterize the pharmacological profile of the receptors mediating the excitatory effect of NT, ii) to investigate the transduction mechanisms of NT receptors and iii) to identify the ionic conductances implicated in the electrophysiologic effect of NT in frog melanotrophs.

We have demonstrated that NT provokes a transient membrane depolarization accompanied by an increase in spike frequency. By using a series of ligands, we have observed a significant correlation between the potencies of various NT(8-13) analogs to stimulate the electrical activity of frog melanotrophs and their binding affinities for rat NTR1 receptors or mouse NTR2 receptors expressed in COS-7. Moreover, the effect of non-peptidic antagonists of NTRs on the electrophysiological response of melanotrophs to NT confirmed that NT receptors expressed by melanotrophs exhibit both similar and distinct pharmocological characteristics with mammalian NTR1 and NTR2 receptors. We have then investigated the transduction pathways associated with activation of NT receptors expressed in melanotrophs. Pretreatment of cells with cholera and pertussis toxins or dialysis of cells with guanosine nucleotide analogs or Gs/i/o and Gq/11 protein antagonists revealed that NTRs are coupled to Gq/11 proteins. Activation of NT receptors stimulated inositol trisphosphate (IP3) production and increased cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). The inhibitory effects of a phospholipase C (PLC) inhibitor and IP3 receptor antagonists on the responses to NT provide evidence for the involvement of both PLC and IP3-induced Ca2+ mobilization from intracellular stores in the electrical and secretory activities evoked by NT. Suppression of extracellular Ca2+ or administration of L- and N-type calcium channel blockers reduced the stimulatory effects of NT on melanotrophs, demonstrating the role of calcium influx through L- and N-type Ca2+ channels in the action potential discharge and alpha-MSH secretion induced by NT. Application of protein kinase C (PKC) inhibitors has revealed the importance of PKC in the maintenance of the responsiveness of melanotrophs to NT. These results indicate that the PLC/PKC signaling pathway and Ca2+ influx are involved in the stimulatory effects of NT on the electrical and secretory activities of melanotrophs. We have also investigated the ionic mechanisms underlying the NT-induced membrane depolarization and action potential discharge. Exposure of cells to Na+, K+ and L- and N-type Ca2+ channel blockers did not modify the membrane depolarization, but inhibited the emission of action potentials evoked by NT. Application of NT to melanotrophs elicited an inward current of positive charges that reversed at approximately -30 mV, a value close to the chloride equilibrium potential. Substitution of chloride ions with gluconate or administration of chloride channel blockers abrogated the effects of NT on membrane potential and ionic current, suggesting that NT-induced membrane depolarization can be accounted for by chloride efflux. Modification of [Ca2+]c by intracellular Ca2+ store depletion or cytosolic Ca2+ chelation, inhibited the electrical response of melanotrophs to NT, demonstrating the Ca2+ sensitivity of the chloride current. At positive potentials, NT also activated outward currents of positive charges that were suppressed by K+ channel blockers. Pretreatment of cells with both calmodulin and Ca2+ calmodulin-dependent protein kinase II (CamKII) inhibitors did not affect membrane depolarization, indicating that CamKII does not mediate the stimulatory effect of NT-induced [Ca2+]c increase on Ca2+-sensitive conductances. NT enhanced Ca2+-activated potassium current (IKCa) that may facilitate the hyperpolarizing post-potentials and relieve the voltage-dependent inactivation of Na+ and Ca2+ currents involved in the action potential discharge.NT reduced the amplitude of voltage-activated L- and N-type Ca2+ currents. However, quantification of Ca2+ currents elicited by action potential waveforms evoked by NT revealed that NT-induced electrical activity enhanced Ca2+ influx by increasing the Ca2+ spike frequency. The inhibitory effect of NT on L- and N-type currents was attenuated by an IP3 receptor antagonist, depletion of intracellular Ca2+ stores, chelation of cytosolic Ca2+ and PKC inhibitors. These results demonstrate that NT reduces L- and N-type Ca2+ currents via activation of the PLC/PKC pathway.

In conclusion, our study has revealed that NT is a potent stimulator of electrical and secretory activities of frog melanotrophs. The stimulatory effect of NT is mediated by Gq/11 protein-coupled receptors whose pharmacological profile exhibits similarities with those of mammalian NTR1 and NTR2. Activation of NTRs stimulates IP3 production that provokes Ca2+ release from intracellular IP3-sensitive stores. Increase in [Ca2+]c activates i) alpha-MSH release, ii) chloride efflux through Ca2+-sensitive Cl- channels that induces membrane depolarization, and iii) PKC that reduces the L- and N-type Ca2+ currents. Membrane depolarization provokes an action potential discharge underlying Ca2+ influx through L- and N-type Ca2+ channels. The resulting [Ca2+]c increase activates calcium-sensitive potassium current involved in hyperpolarizing post-potentials necessary to maintain the cell excitability. Both Ca2+ mobilization from intracellular stores and Ca2+ influx through membrane Ca2+ channels are envolved in NT-induced alpha-MSH secretion in frog melanotrophs.

Mots-clés : non communiqué

Présentée le 11 juin 2004

Laboratoire où a été préparée la thèse:

Laboratoire de Neuroendocrinologie Cellulaire et Moléculaire, IFRM 23, Unité INSERM 413, Université de Rouen, 76821 Mont-Saint-Aignan Cedex

Nom des Directeurs de thèse: Dr Estelle Louiset et Dr Hubert Vaudry